使用伯樂T100梯度PCR儀時，除了遵循常規(guī)PCR操作規(guī)范外，還有一些針對該型號儀器的關鍵細節(jié)和注意事項。熟練掌握這些細節(jié)能顯著提高實驗的重復性和成功率。以下是從操作前、操作中到操作后的詳細注意事項：

一、BioRad伯樂T100PCR儀 開機前與程序設置階段

1、儀器預熱與校準：

（1）儀器剛開機，建議預熱10-15分鐘，讓熱蓋和樣品槽溫度穩(wěn)定，確保溫度的準確性。

（2）定期進行溫度校準（尤其是當實驗結果出現(xiàn)系統(tǒng)性偏差時）。這通常需要使用專用的校準儀或由專業(yè)技術人員完成。

2、程序設置與驗證：

（1）理解梯度功能： 明確梯度的設置范圍。T100的梯度功能是在樣品槽的同一排（通常是縱向） 設置一個線性溫度梯度。例如，設置梯度為60°C到50°C，意味著同一排從左到右（或從右到左）溫度線性遞減。請勿在設置梯度的一排放置不同引物或模板的樣品，否則結果無法解讀。

（2）合理設置梯度范圍： 初次進行退火溫度優(yōu)化時，梯度范圍可以設寬一些（如10-12°C）。根據(jù)結果縮小范圍進行精細優(yōu)化。范圍過寬可能會超出酶的適宜溫度。

（3）確認熱蓋溫度： 根據(jù)使用的管型（如0.2mL單管、八連排管）正確設置熱蓋溫度。通常使用默認的105°C即可，確保管蓋被緊密壓住，防止蒸發(fā)。

（4）程序命名與保存： 為每個程序設置一個清晰易懂的名稱并保存，避免下次使用時輸錯參數(shù)。

二、伯樂T100梯度PCR儀樣品準備與放置階段

1、樣品管選擇與質量：

（1）使用平蓋、薄壁的專用PCR管/板。管壁厚度不均或拱形蓋會嚴重影響熱傳導，導致溫度不準和蒸發(fā)。

（2）確保管蓋緊閉。放置前，可以用指尖輕輕按壓每個管蓋確認。

2、反應體系配置：

（1）確保反應液在管底，不要掛在管壁或蓋上。短暫離心將所有液體收集到管底。

（2）體系體積不宜過小，對于0.2mL的管，建議不少于10μL，以保證溫度感應的準確性。

3、樣品放置的“黃金法則"：

（1）對稱放置： 無論是否使用梯度，都盡量將樣品對稱放置在樣品槽中。這有助于熱場均勻，減少邊緣效應。

（2）梯度實驗的放置： 進行梯度實驗時，必須將同一反應體系的多個重復樣本，放置在梯度設置的那一排上。例如，你要優(yōu)化一個引物的退火溫度，你需要準備8個相同的PCR反應管，然后全部放在儀器上用于梯度的那一排（通常是縱向的一列），儀器會自動為每個管分配不同的退火溫度。

（3）非梯度實驗的放置： 即使不做梯度實驗，也建議將樣品放在樣品槽中部區(qū)域，避免最外圈，因為邊緣的溫度波動可能稍大。

（4）標記位置： 在放置樣品時，在管蓋或排架上用記號筆標記位置（如A1， B2），以便后續(xù)準確記錄哪個樣品在哪個位置。

三、伯樂T100梯度PCR儀運行階段

1、運行前最終檢查：

（1）再次確認程序參數(shù)（溫度、時間、循環(huán)數(shù)）是否正確。

（2）確認熱蓋已經(jīng)緊密閉合，聽到“咔嗒"聲。

（3）檢查儀器屏幕顯示的狀態(tài)是否為“Ready"或“Idle"。

2、運行中：

（1）儀器運行時，請勿頻繁打開熱蓋，這會嚴重干擾溫度控制。

（2）注意觀察儀器運行是否正常，有無異常報警聲。T100的屏幕會顯示當前運行的步驟和剩余時間。

四、 運行結束后

1、取回樣品：

（1）程序結束后，儀器會自動將樣品槽降溫至4°C或12°C（根據(jù)設置）進行保溫。盡快取出樣品，以免冷凝水在管內(nèi)積聚。

（2）取出時小心燙傷，雖然樣品槽溫度不高，但熱蓋部分可能仍有余溫。

2、數(shù)據(jù)記錄：

這是梯度PCR最關鍵的一步！ 立即記錄下每個樣品在樣品槽中的精確位置以及該位置對應的實際梯度溫度。你可以在儀器的運行日志或程序結果中找到這個溫度列表。沒有這個對應關系，梯度實驗就失去了意義。

3、儀器維護：

（1）保持清潔： 定期用70%乙醇濕潤的無塵紙擦拭樣品槽和熱蓋，去除灰塵、油污和溢出的樣品。切勿使用強酸、強堿或高濃度酒精，以免腐蝕金屬表面。

（2）防止污染： 如果有樣品泄漏，務必立即清潔，防止基因組DNA或PCR產(chǎn)物交叉污染后續(xù)實驗。

（3）長期不用： 如果長時間不使用，請拔掉電源，并用防塵罩蓋好。

總結：

使用伯樂T100的核心在于 “理解梯度、規(guī)范放置、準確記錄" 。只要在實驗設計時想清楚如何利用梯度功能，在操作時細心規(guī)范，并養(yǎng)成及時記錄的好習慣，就能充分發(fā)揮這臺高性能儀器的優(yōu)勢，為您的實驗帶來極大的便利。