本指南為通用操作流程，不能替代操作手冊(cè)。在進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)務(wù)必接受相關(guān)培訓(xùn)并仔細(xì)閱讀儀器和試劑的使用說(shuō)明書(shū)。整個(gè)操作過(guò)程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，防止RNA/DNA降解和PCR污染。

一、賽默飛QuantStudio3實(shí)時(shí)熒光定量PCR上機(jī)運(yùn)行

1、開(kāi)機(jī)與初始化

（1）打開(kāi)電腦、顯示器。

（2）打開(kāi)QuantStudio 3主機(jī)背面的電源開(kāi)關(guān)。儀器會(huì)進(jìn)行自檢，發(fā)出“嘀"聲，樣品塊會(huì)移動(dòng)。等待自檢完成，樣品塊停止運(yùn)動(dòng)后再進(jìn)行下一步。

2、創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)

（1）雙擊桌面上的 “QuantStudio Design & Analysis Software" 圖標(biāo)，啟動(dòng)軟件。

（2）點(diǎn)擊軟件左上角的 “New Experiment"（新建實(shí)驗(yàn)）。

（3）在彈出的窗口中選擇實(shí)驗(yàn)類(lèi)型：

Standard Curve (Absolute Quantification)：定量，用于計(jì)算拷貝數(shù)。

Comparative ΔΔCt (Relative Quantification)：相對(duì)定量，用于計(jì)算基因表達(dá)差異。

Melt Curve：溶解曲線，通常與SYBR Green法聯(lián)用。

Genotyping：基因分型。

（4）選擇完成后，點(diǎn)擊 “Create"。

3、設(shè)置板子布局

（1）軟件界面會(huì)顯示一個(gè)虛擬的96孔板。

（2）在左側(cè)的 “Well Inspector" 面板中，為每個(gè)孔或一組孔（可拖選）定義屬性：

Sample Name：樣本名稱（如：Sample1, Control等）。

Task：任務(wù)類(lèi)型（Unknown-待測(cè)樣本；NTC-無(wú)模板陰性對(duì)照；Standard-標(biāo)準(zhǔn)品）。

Reporter：選擇熒光染料（如：FAM, VIC等。SYBR Green通常選SYBR）。

Quencher：選擇對(duì)應(yīng)的淬滅基團(tuán)（如：None, TAMRA等）。

Quantity：如果設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)品，在此處輸入標(biāo)準(zhǔn)品的已知度。

4、運(yùn)行實(shí)驗(yàn)

（1）將密封好的反應(yīng)板放入儀器樣品槽中，確保板子方向正確（A1孔在左上角）。

（2）在軟件界面右上角，點(diǎn)擊 “Start Run"（開(kāi)始運(yùn)行）。

（3）彈出窗口中確認(rèn)實(shí)驗(yàn)名稱、保存路徑和反應(yīng)板類(lèi)型，然后點(diǎn)擊 “OK"。

（4）儀器將開(kāi)始運(yùn)行程序，你可以在軟件界面上實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)增曲線和熒光信號(hào)的變化。

二、賽默飛QuantStudio3實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)分析

運(yùn)行結(jié)束后，軟件會(huì)自動(dòng)分析數(shù)據(jù)。

1、查看擴(kuò)增曲線

在“Results"頁(yè)面下的“Amplification Plot"中查看所有孔的擴(kuò)增曲線。理想的曲線應(yīng)是“S"型，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增或Ct值很大（通常>35）。

2、設(shè)置基線閾值

軟件會(huì)自動(dòng)設(shè)置基線和閾值（Threshold），但有時(shí)需要手動(dòng)調(diào)整。確保閾值位于所有擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)期內(nèi)，且與基線區(qū)分明顯。

3、查看結(jié)果

點(diǎn)擊“Plate"選項(xiàng)卡，可以以表格形式查看每個(gè)孔的Ct值、起始拷貝數(shù)（定量）或ΔΔCt值（相對(duì)定量）等。

對(duì)于相對(duì)定量，軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的基因表達(dá)變化倍數(shù)。

4、導(dǎo)出數(shù)據(jù)

可以通過(guò) “File" -> “Export" 將數(shù)據(jù)導(dǎo)出為Excel或CSV格式，用于進(jìn)一步作圖或統(tǒng)計(jì)分析。

三、日常維護(hù)與注意事項(xiàng)

1、清潔：定期用柔軟的濕布擦拭儀器表面。如果發(fā)生污染，用70%乙醇擦拭樣品塊表面。

2、關(guān)機(jī)：通常不需要關(guān)閉儀器電源，保持待機(jī)狀態(tài)即可。如需長(zhǎng)期不用，可關(guān)閉主機(jī)電源。

3、安全：在運(yùn)行前后及取放板子時(shí)，注意樣品塊溫度可能很高，防止?fàn)C傷。

4、故障排查：如果遇到異常曲線（如起跳晚、信號(hào)弱、陰性對(duì)照有擴(kuò)增），請(qǐng)從模板質(zhì)量、引物探針設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系配制、污染等方面逐一排查。